ゲノム編集を制御する新たな技術

Ｓｐｌｉｔ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１の開発

2019-08-13 東京大学,科学技術振興機構

ポイント

新たなゲノム編集ツールとして注目されているＣｐｆ１タンパク質を二分割したｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１を新たに開発した。
Ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１を用いて、光刺激による精度の高いゲノム編集や、極めて高い効率で遺伝子発現を制御することに成功した。
Ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１によるゲノム編集の技術開発により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１によるゲノムエンジニアリングが今後、さらに展開することが期待される。

東京大学大学院総合文化研究科の二本垣裕太　大学院生（現　ジョンズホプキンズ大学医学部細胞生物学科　博士研究員）、小田部尭広　特任研究員、佐藤守俊　教授らの研究グループは、Ｃｐｆ１タンパク質を二分割して得た分割体（ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１）に基づいて、ゲノム（遺伝子）編集を光によって制御したり、より効率的に遺伝子を発現したりできるツールを開発することに成功しました。

近年報告されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１^注１）は、従来技術のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９^注２）よりも標的ＤＮＡへの特異性が高いため、オフターゲット効果^注３）が小さく精度の高いゲノムエンジニアリング技術になると期待されています。しかし、Ｃｐｆ１の分子構造がＣａｓ９とは大きく異なるため、Ｃａｓ９を基に開発されてきた応用技術が、そのままではＣｐｆ１に適用できないという問題がありました。本研究では、この問題を解決するためにＣｐｆ１を分割してｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１を開発し、光刺激による精度の高いゲノム編集や極めて高い効率での遺伝子発現制御を実現しました。Ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１を基盤として、生体でのゲノムエンジニアリング^注４）がさらに発展することが期待されます。

本研究成果は、米国科学誌「ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ」（電子版：英国時間８月１２日）に掲載されます。

本研究成果は、国立研究開発法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）の戦略的創造研究推進事業（ＣＲＥＳＴ）「光の特性を利用した生命機能の時空間制御技術の開発と応用」（研究総括：影山龍一郎　京都大学ウイルス・再生医科学研究所　教授）における「ゲノムの光操作技術の開発と生命現象解明への応用」（研究代表者：佐藤守俊　教授）および同大学発新産業創出プログラム（ＳＴＡＲＴ）^注５）「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを光制御するゲノムエンジニアリングツール」（研究代表者：佐藤守俊　教授）の一環として得られました。

＜研究背景＞

ゲノム（遺伝子）編集技術としてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９が発表されて以来、ゲノム上の狙った遺伝子の機能を破壊したり（ノックアウト）、別の塩基配列に置き換えたりすること（ノックイン）が簡単にできるようになりました。また、Ｃａｓ９を用いた応用技術により、ゲノム上の狙った遺伝子の発現量を上げたり、下げたりすることも可能になりました。このようなＣａｓ９に基づくゲノムエンジニアリング技術は、基礎研究から医療や創薬、食物の品種改良といった身近な分野にまで広く応用されています。

近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１がゲノム編集技術として利用できることが報告されました（参考文献１、２、３、４）。Ｃｐｆ１は、ガイドＲＮＡと結合し、ガイドＲＮＡの一部と相補的な二本鎖ＤＮＡを認識します。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９と比べて標的ＤＮＡへの特異性が高く、オフターゲット効果が小さいことが大きな特徴です。また、ガイドＲＮＡを自身で切り出せる機能を持っていて、複数の遺伝子を同時に標的にすることもできます。しかし、Ｃｐｆ１の分子構造はＣａｓ９とは大きく異なるため、Ｃａｓ９を基に開発されてきた応用技術が、そのままではＣｐｆ１に適用できないという問題がありました。

＜研究内容＞

本研究グループは、上述の問題を解決するために、Ｃａｓ９を分割することで化合物または光刺激によりゲノム編集を誘導できることに着目し、まずＣｐｆ１をさまざまな箇所で二分割しました。得られた３４種類の分割体（ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１）の中には、そのままではＮ末端断片とＣ末端断片^注６）が会合しないものが含まれていました。分割したｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１のＮ末端断片とＣ末端断片が会合しないと、標的の遺伝子に結合できないことから、会合を外部から誘導することが必要です。この“誘導型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”に、本研究グループが開発した光スイッチタンパク質“Ｍａｇｎｅｔシステム”^注７）（参考文献５）を連結することで、青色光のオン／オフによりＤＮＡ切断活性をオン／オフに誘導することができる光活性化型のＣｐｆ１（ｐａＣｐｆ１）を開発しました（図１）。そこで、ヒトＤＮＭＴ１遺伝子^注８）を標的としたゲノム編集を指標としてｐａＣｐｆ１を評価したところ、暗所ではｐａＣｐｆ１は全くＤＮＡ切断活性を示さずヒトＤＮＭＴ１遺伝子の塩基配列を編集しませんでしたが、青色光を照射するとＤＮＡ切断活性が観察され、当該遺伝子のゲノム編集を実行できることが確認できました。また、ｐａＣｐｆ１のオフターゲット効果を検証したところ、ｐａＣｐｆ１のオフターゲット効果は、二分割しても、Ｃｐｆ１と同程度に小さいことも明らかになりました。

今回、Ｃｐｆ１の二分割で得られたｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１の中には、上述の“誘導型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”に加えて、Ｎ末端断片とＣ末端断片が自然と会合して機能する“自発会合型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”も含まれていることが分かりました。本研究グループは、Ｃａｓ９について“誘導型”の分割体（ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９）を報告していますが（参考文献６、７）、ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて“自発会合型”として細胞内で高いＤＮＡ切断活性を示したのは、本研究の“自発会合型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”が初めてです。

本研究グループでは、“自発会合型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”を用いて、極めて高い効率で遺伝子発現を活性化できる技術を開拓しました。“自発会合型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”には、Ｃｐｆ１が本来持っているＮ末端とＣ末端に加えて、分割によって新しく生じたＮ末端とＣ末端があります。Ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１のＤＮＡ切断活性を欠失させる変異を導入した（“ｓｐｌｉｔ－ｄＣｐｆ１”と呼ぶ）上で、ｓｐｌｉｔ－ｄＣｐｆ１の４つの末端の全てに転写活性化因子^注９）と核局在化シグナル配列^注１０）を連結し、遺伝子発現の活性化技術として“ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０”を開発しました（図２）。培養細胞における内在性遺伝子の発現を指標として当該技術を評価したところ、“ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０”は、ＣＲＩＳＰＲ–Ｃａｓ９を用いた従来技術（参考文献８）よりもはるかに高い効率で遺伝子発現を活性化できることが分かりました。

さらに、本研究グループは、マウスの生体内でも“ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０”が効率よく遺伝子発現を活性化できることを示しました。マウスの肝臓に“ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０”を導入したところ、当該臓器でルシフェラーゼ^注１１）のタンパク質が効率よく発現していることが分かりました（図３ａ、ｂ）。ちなみに、ｄＣｐｆ１を用いた既存技術（ｄＣｐｆ１－ＶＰＲ）（参考文献９）では、ルシフェラーゼの発現がほぼ観察できませんでした（図３ａ、ｂ）。また、内在性遺伝子の発現を指標に評価したところ、“ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０”は、当該遺伝子の発現をマウスの生体内で非常に強く活性化できることが示されました（図３ｃ）。

上述のように本研究グループは、新たに“誘導型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”による青色光によるゲノム編集の光操作技術（ｐａＣｐｆ１）を開発するとともに、“自発会合型のｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１”に基づいて、遺伝子発現の活性化技術（ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０）を開発しました。本研究により、光刺激による精度の高いゲノム編集や極めて高い効率での遺伝子発現を制御することができます。今後、ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１を基盤として、生体でのゲノムエンジニアリングがさらに発展するとともに、生命科学の原理・現象の解明につながることが期待されます。

＜参考図＞

図１　本研究で開発した光活性化型Ｃｐｆ１（ｐａＣｐｆ１）の模式図

Ｓｐｌｉｔ－Ｃｐｆ１のＮ末端断片とＣ末端断片に光スイッチタンパク質（Ｍａｇｎｅｔシステム）を連結して、光活性化型Ｃｐｆ１（ｐａＣｐｆ１）を開発した。ｐａＣｐｆ１は青色の光を照射すると、Ｍａｇｎｅｔシステムの結合に伴って、本来のＣｐｆ１のようにＤＮＡ切断活性を回復し、標的遺伝子を切断する（スイッチオン）。青色光の照射を止めると、Ｍａｇｎｅｔシステムが乖離し、ＤＮＡ切断活性を失う（スイッチオフ）。

図２　本研究で開発した自発会合型Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０）

Ｓｐｌｉｔ－ｄＣｐｆ１には、本来のＮ末端とＣ末端に加えて、分割によって新しく生じたＮ末端とＣ末端がある。この４つの末端の全てに転写活性化因子および核局在化シグナル配列を連結することで、標的遺伝子を強力に活性化することが可能になった。

図３　マウスの肝臓におけるルシフェラーゼレポーターの応答

（ａ）マウスの肝臓での遺伝子発現を、ルシフェラーゼをレポーターとして用いることで可視化した。ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０は、ネガティブコントロール（ｃｒＮｅｇ）およびｄＣｐｆ１を用いた既存技術（ｄＣｐｆ１－ＶＰＲ）と比べて、非常に高い効率でルシフェラーゼの発現を誘導した。

（ｂ）図３ａの画像データから遺伝子発現を数値データで示している。

（ｃ）内在性遺伝子（Ａｓｃｌ１）の発現を指標に評価した結果、ｄＣｐｆ１－ＳＡ２．０は、当該遺伝子の発現を、マウスの肝臓で、既存技術（ｄＣｐｆ１－ＶＰＲ）よりもはるかに強く、活性化できることが示された。

＜用語解説＞

注１）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１: ゲノムの切断を人為的に行うための技術。Ｃｐｆ１と呼ばれるＤＮＡ切断酵素がガイドＲＮＡとともにＤＮＡに結合し、そのＤＮＡ配列を部位特異的に切断する。このＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムは、バクテリオファージに対する原核生物の免疫システムとして発見された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９と同様にゲノム編集に利用されている。

注２）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９: ゲノムの切断を人為的に行うための技術。Ｃａｓ９と呼ばれるＤＮＡ切断酵素がガイドＲＮＡとともにＤＮＡに結合し、そのＤＮＡ配列を部位特異的に切断する。このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、バクテリオファージに対する原核生物の免疫システムとして発見されたが、２０１２年以降、ゲノム編集に利用されている。

注３）オフターゲット効果: 本来の標的とする配列以外の類似配列を認識してしまい、意図しない変異が生じてしまうこと。

注４）ゲノムエンジニアリング: ゲノム上の遺伝子の塩基配列を改変してその機能を破壊したり（ノックアウト）、別の塩基配列で置き換える（ノックイン）技術や遺伝子発現の亢進・抑制をしたり、特定の遺伝子を書き換える技術のこと。

注５）大学発新産業創出プログラム（ＳＴＡＲＴ：ＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＣｒｅａｔｉｎｇＳＴａｒｔ－ｕｐｓｆｒｏｍＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）: 日本の大学などの基礎研究成果に関し、大学等発ベンチャーなどを通じた新規マーケットへの事業展開が十分に行われていない現状を踏まえて、平成２４年度に文部科学省により「大学発新産業創出拠点プロジェクト」として創設され、平成２７年度より科学技術振興機構が実施している制度。本制度では、事業化ノウハウを持った人材（事業プロモーター）ユニットを活用して、大学などのポテンシャルの高いシーズの事業化を通じて新産業の創出、新規マーケットの開拓を目指す。大学等発ベンチャーの起業前段階から公的資金と民間の事業化ノウハウを組み合わせることにより、事業戦略・知財戦略を構築しつつ、既存企業にはリスクの負えないポテンシャルの高いシーズの事業化への挑戦を支援する。本プログラムの成果として「遺伝子や生命の働きをコントローラブルに」をコンセプトとした大学発ベンチャー「株式会社ミーバイオ」が平成３１年４月１日に設立された。本ベンチャーは遺伝子改変動物を提供する事業からスタートし、特定疾患モデルマウスの受託開発や受精卵のライセンス販売を目指す。

注６）Ｎ末端断片とＣ末端断片: 酵素（タンパク質）はアミノ酸のアミノ基とカルボキシ基がペプチド結合でつながったポリマー。このポリマーの末端のアミノ基側を含む部分をＮ末端断片、カルボキシ基側を含む部分をＣ末端断片と呼ぶ。

注７）Ｍａｇｎｅｔシステム: Ｍａｇｎｅｔシステムは、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）が有する小さな光受容体のヴィヴィッド（Ｖｉｖｉｄ）に対して多角的にプロテインエンジニアリングを施して開発されたタンパク質の対である。暗所では単量体として存在し、青い光を受容するとヘテロ二量体を形成する。; 光による単量体と二量体の変換を利用して、さまざまな光活性化型のツールを設計・開発することができる。

注８）ＤＮＭＴ１遺伝子: ヒト１９番染色体にコードされた遺伝子。ＤＮＡのメチル化の制御に関わる。

注９）転写活性化因子: 転写を開始するために必要な複合体を呼び寄せて、転写を活性化するための因子のこと。

注１０）核局在化シグナル配列: 細胞質で合成されたタンパク質を核に運び、局在化させるアミノ酸配列のこと。

注１１）ルシフェラーゼ: ホタルや発光キノコなどの、生物発光を触媒する酵素のこと。遺伝子発現のレポーターとして使われている。

＜論文タイトル＞

“A split CRISPR–Cpf1 platform for inducible genome editing and gene activation”: 著者名：Yuta Nihongaki, Takahiro Otabe, Yoshibumi Ueda, Moritoshi Sato; ＤＯＩ：10.1038/s41589-019-0338-y