酸性でも光刺激でオン・オフできる緑色蛍光たんぱく質ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓ

2019-08-202021-06-13

生体内の酸性環境を高解像度で観察する新技術

2019-08-20　大阪大学,科学技術振興機構

ポイント

生物試料を超解像観察するための光スイッチング蛍光たんぱく質、ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓを開発した。
ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓは光刺激により、蛍光のオン・オフ制御を行うことができる。
従来の可逆的光スイッチ蛍光たんぱく質は全て、ｐＨ５～６以下の酸性環境で蛍光を失うという課題があったが、ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓはｐＨ４．５～９．０の細胞環境ｐＨで、安定した強度の蛍光を放つ。
酸性環境中の未知の生命現象を発見する基盤技術となり、医学・創薬研究への貢献も期待される。

大阪大学産業科学研究所の永井健治　教授らの研究グループは、ｐＨ４．５～９．０の細胞環境で安定して蛍光^注１）する、耐酸性の光スイッチ型緑色蛍光たんぱく質^注２）“ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓ”の開発に成功しました。特殊な顕微鏡法と組み合わせることで、光の回折限界^注３）を超えた分解能で、生きた生物試料の高解像度画像を撮影できるようになります。

研究グループは昨年、日本産ハナガサクラゲの光る触手から新規の蛍光たんぱく質を単離改変することによりｐＨ４．５～９．０の細胞環境で安定して蛍光する耐酸性の緑色蛍光たんぱく質“Ｇａｍｉｌｌｕｓ”を開発しました。

今回、吸収スペクトル測定とＸ線結晶解析^注４）により、酸性環境下において、Ｇａｍｉｌｌｕｓの蛍光・非蛍光状態が光刺激により可逆的に切り替わること（光スイッチ）、そのメカニズムが蛍光発色団^注５）のｔｒａｎｓ－ｃｉｓ異性化並びにフェノール水酸基のプロトン化／脱プロトン化であることを見いだしました（図１）。このメカニズムを基にした分子設計、遺伝子変異導入により、光スイッチのコントラストを向上させた変異体ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓを開発しました。

現在までに報告されている可逆的光スイッチ蛍光たんぱく質が全てｐＨ５～６以下の酸性環境で蛍光を失うのに対して、ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓは酸性環境でも安定した蛍光を放ち、細胞内のほぼ全てのｐＨ環境で使用可能であることが分かりました（図２左）。人工的に模した細胞酸性環境中（ｐＨ４．５）で、１分子蛍光の輝点重心位置の計測に基づく超解像顕微鏡観察に応用できることを証明しました（図２右）。酸性細胞小器官は、２０１６年のノーベル医学・生理学賞受賞者の大隅良典　博士が発見したオートファジーなど、多くの生命機能に密接に関わっています。しかし、既存の光スイッチ型の蛍光たんぱく質は、低ｐＨで蛍光しないため、酸性細胞小器官内での使用が限られていました。

ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓは、酸性環境中の未知の生命現象を発見するための基盤技術となり、医学・創薬研究にも大きく貢献すると期待されます。

本研究成果は、２０１９年８月１５日に「ＣｅｌｌＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ」（オンライン）に掲載されました。

本研究は科学技術振興機構（ＪＳＴ）戦略的創造研究推進事業ＣＲＥＳＴ「超解像『生理機能』イメージング法の開発と細胞状態解析への応用」（研究代表者：永井健治）の一環として行われました。

＜研究の背景＞

リソソームなどの酸性細胞小器官（５０～１５００ｎｍ）は、生体分子や細胞内小器官との融合や分裂を通して、生体分子の修飾・輸送・分解など、生命活動に幅広く関わります。２０１６年のノーベル医学・生理学賞を受賞した大隅良典　博士が発見したオートファジーも、酸性細胞小器官が関わる生命現象の一例です。植物細胞においては、細胞内酸性小器官に加えて、細胞間隙（細胞壁）が酸性に保たれています。細胞間隙は、単なる物質輸送だけでなく、物質代謝や成長にも関わる極めて重要な場です。

超解像顕微鏡法は、生きた細胞内の生体分子の局在や動態を、光の回折限界（～３００ｎｍ）を超えた解像度で観察することができる画期的な手法です。観察対象である生体分子を標識するための蛍光タグと、特殊な照明パターン（スキーム）を組み込んだ顕微鏡の２つが必要です。光スイッチ型の蛍光たんぱく質をタグとして用いる超解像法は、たんぱく質を簡便に標識でき、細胞に対する毒性も比較的小さいことから、幅広い研究者に利用されています。しかし、現在報告されている光スイッチ型の蛍光たんぱく質の多くは、ｐＨ５～６以下の酸性環境で消失するといった問題点があります。従って、酸性細胞小器官の細かい動態や、酸性細胞環境中の微小構造を調査するためにも、耐酸性で緑色の蛍光たんぱく質が強く求められていました。

＜本研究成果が社会に与える影響（本研究成果の意義）＞

本研究成果を応用することで、酸性細胞小器官の動態や、酸性細胞環境中の微細構造を、より鮮明にライブ観察できるようになります。一方で、酸性細胞環境中の複数たんぱく質の相互動態を調べるためには、緑色に加えて、青・赤色領域の耐酸性の光スイッチ型蛍光たんぱく質の新規開発と、それを併用したマルチカラーでの超解像観察法が今後必要となります。こうした新規ツール開発を通じて、酸性細胞環境で起こる未知の生命現象の発見と、酸性環境中の分子異常が関わる疾病メカニズムの詳細解明が期待されます。

＜参考図＞

図１　Ｇａｍｉｌｌｕｓ、ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓの光スイッチの分子メカニズム

緑色光刺激により、蛍光発色団中のフェノール環がｔｒａｎｓ－ｃｉｓ異性化し、プロトン化されることで、スイッチオフする。紫外光刺激により、元の蛍光状態に戻る。

図２

（左）ｐＨと蛍光たんぱく質の蛍光強度の相関図。

（右）人工的に模した酸性細胞環境（ｐＨ４．５）中における、アクチンという細胞骨格たんぱく質をｒｓＧａｍｉｌｌｕｓで標識した哺乳類細胞の蛍光画像。超解像顕微鏡観察により、分解能の向上した細胞画像を取得できることを証明した。

＜用語解説＞

注１）蛍光: 光を吸収し、その光よりも低エネルギー（長波長）の光を放出する物質の性質のこと。ｒｓＧａｍｉｌｌｕｓは青色光（～５００ｎｍ）を吸収し、緑色光（～５２０ｎｍ）を放出する。

注２）蛍光たんぱく質: 蛍光を発するたんぱく質の総称。２００８年のノーベル化学賞で知られる下村修　博士らが、１９６２年にオワンクラゲから初めて遺伝子を単離し、緑色蛍光たんぱく質（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）と命名した。

注３）光の回折限界: 通常の光学イメージングでは、光学的な収差のない理想のレンズを用いた場合でも、試料面上の輝点はカメラ上である程度の広がり（～３００ｎｍ）を持って集光する。像として識別することができる２点間の最小距離を回折限界という。

注４）Ｘ線結晶解析: 結晶化した分子にＸ線を照射し、回折を記録・解析することで、その立体構造を約０．１～１ｎｍの精度で求めることができる手法。

注５）蛍光発色団: 蛍光たんぱく質中の、実際に蛍光現象に関わる部位を蛍光発色団と呼ぶ。ＧａｍｉｌｌｕｓとｒｓＧａｍｉｌｌｕｓの場合、グルタミン・チロシン・グリシンの３アミノ酸から、自己触媒的に蛍光発色団が形成される。

＜論文タイトル＞

“Acid-tolerant reversibly switchable green fluorescent protein for super-resolution imaging under acidic conditions”: ＤＯＩ：10.1016/j.chembiol.2019.07.012