たんぱく質の構造や動きを解析する新技術を開発～情報・数理科学の応用によるＮＭＲ法の革新～

2020-01-31 理化学研究所,東京工業大学,科学技術振興機構

ポイント

理化学研究所（理研）生命機能科学研究センター細胞構造生物学研究チームの葛西卓磨　研究員（ＪＳＴ　さきがけ研究者）、木川隆則　チームリーダー（東京工業大学情報理工学院　特定教授）、東京工業大学情報理工学院情報工学系の小野峻佑　准教授（ＪＳＴ　さきがけ研究者）らの共同研究グループは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法^注１）に情報・数理科学の手法を応用することで、従来は解析が困難だった重なり合うＮＭＲ信号^注１）を分離し、たんぱく質の構造や動きなどに関する情報を得る新たな方法「ＳｉＰｅｘ（Ｓｔａｂｌｅ－ｉｓｏｔｏｐｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄＰａｒａｍｅｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法」を開発しました。

本研究成果は、たんぱく質の機能に関する基礎研究に貢献し、たんぱく質と医薬品候補分子の結合状態の解析に基づく創薬研究を加速させると期待できます。

ＮＭＲ法は、強い磁場中に置かれた原子核から発せられる信号（ＮＭＲ信号）を観測し、分子の構造を解析する手法です。たんぱく質の解析では、ＮＭＲ法で観測可能な安定同位体^注２）で標識した試料を用いることが標準的です。

今回共同研究グループは、先行研究で開発した「符号化標識法^注３）」と数理科学の応用により、重なり合う複数のＮＭＲ信号からでも、アミノ酸の情報とたんぱく質の性質の情報を取得することに成功しました。

本研究は、科学雑誌「ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＮＭＲ」のオンライン版（２０２０年１月３０日付）に掲載されました。

本研究の一部は、ＪＳＴ戦略的創造研究推進事業さきがけ「計測技術と高度情報処理の融合によるインテリジェント計測・解析手法の開発と応用（研究総括：雨宮慶幸、副研究総括：北川源四郎）」の研究課題「試料への情報の符号化を活用するＮＭＲ計測・解析法（研究者：葛西卓磨）」および「統合的凸最適化によるＩｎＨａｎｄな成分分離型信号情報再構成（研究者：小野峻佑）」、戦略的創造研究推進事業ＣＲＥＳＴ「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」の研究課題「ＮＭＲと計算科学の融合によるｉｎｓｉｔｕ構造生物学の確立と真核細胞内蛋白質の動態研究への応用」による支援を受けて行われました。

＜背景＞

アミノ酸が連なってできたたんぱく質は、その構造と動きによって分子機能が決まります。そのため、たんぱく質の構造や動きの解析は、その機能を解明する上で重要です。核磁気共鳴（ＮＭＲ）法は、強い磁場中に置かれた原子核に電磁波を照射すると、原子の置かれた状況によって特徴的な信号（ＮＭＲ信号）が観測される物理現象（核磁気共鳴）を応用した、分子構造などの解析法です。生体環境に近い溶液中でたんぱく質分子に含まれる原子を直接観測できるという特長から、たんぱく質の構造、機能、動き、作用機序の解明に欠かせません。

ＮＭＲ法でたんぱく質の解析を行うには、まず、複数の原子から発せられるそれぞれのＮＭＲ信号が、どの原子に由来するかを決める「信号帰属」を行います。たんぱく質の解析では、炭素１３（^１３Ｃ）や窒素１５（^１５Ｎ）の安定同位体でアミノ酸を標識し、信号帰属を効率良く行うことが標準的な方法となっています。

測定されたＮＭＲ信号は２次元平面上のスペクトル^注４）で表すことができますが、複数の信号が同じ位置に重なると、信号帰属が困難になります。ＮＭＲ信号の重なりは、異なる位置の原子に由来する信号が分離しにくい天然変性たんぱく質^注５）、信号の数が多い高分子量たんぱく質、一つ一つの信号の広がりが大きくなってしまう生細胞内のたんぱく質などで著しく生じ、たんぱく質の一部の構造や動きについての情報しか得られず、解析は不完全なものになってしまいます。

信号が重なった場合にも信号帰属を補助する情報を提供し、重なった信号を分離しつつ、たんぱく質の性質を解析する方法があれば、これまで解析が困難であったたんぱく質の部位をもＮＭＲ法によって解析することができます。また、解析は可能であっても信号帰属に時間がかかっていたたんぱく質を、迅速に解析できるようになることも期待されます。

＜研究手法と成果＞

葛西卓磨　研究員らは、２０１５年に「符号化標識法」を開発しました^※）。ＮＭＲ解析における安定同位体標識の標準的な方法では、たんぱく質中の安定同位体の有無の情報だけを利用するのに対し、符号化標識法では、アミノ酸の情報をたんぱく質に「符号化」し、アミノ酸ごとに異なる安定同位体標識パターン（符号語）を割り当てたたんぱく質試料を用います。一例としては、^１５Ｎでの３つの標識率（１００パーセント、７５パーセント、５０パーセント）と、^１３Ｃでの３つの標識率（１００パーセント、５０パーセント、０パーセント）の組み合わせでアミノ酸を標識したたんぱく質（標識体）を３パターン用意し、それぞれをＮＭＲで計測します。これにより、観測されたＮＭＲスペクトルから、アミノ酸の情報を「復号」して取り出せるようにしておきます（図１）。

本研究で開発した「ＳｉＰｅｘ法」は、符号化標識法を応用したもので、この標識パターンを単にアミノ酸の情報を取り出すだけではなく、重なった信号を分離する手掛かりとしても用います。まず、符号化標識したたんぱく質試料を用いて、アミノ酸の情報を得るための測定と、^１５Ｎ緩和速度^注６）などたんぱく質の性質を得るための測定を行い、これらを組み合わせて解析します。測定ごとに得られるＮＭＲスペクトルは２次元ですが、それらを集めて、全体では４次元のテンソル^注７）であると見なし、テンソル分解^注７）という数理解析手法で信号ごとに分離します。分離された各成分の３次元目のシグナル強度にはアミノ酸の情報が含まれており、符号語表と照らし合わせて解析することで、アミノ酸の情報を復号することができます。また、各成分の４次元目の強度は、^１５Ｎ緩和速度の情報を持っており、たんぱく質の動きの情報を取り出すことができます。このように、たんぱく質のＮＭＲ解析において障害となっていた信号の重なりの問題を解決しつつ、信号帰属の助けとなるアミノ酸情報と、たんぱく質の動きなど性質に関する情報を同時に取り出すことができるのが、ＳｉＰｅｘ法の特長です（図２）。

共同研究グループは、ＳｉＰｅｘ法の性能を評価するため、ユビキチンと呼ばれるたんぱく質をモデルにした実証実験を行いました。従来のＮＭＲ法によるたんぱく質の測定では、１５～１６番目のＬＥ（ロイシン－グルタミン酸）というアミノ酸の並びと、２５～２６番目のＮＶ（アスパラギン－バリン）というアミノ酸の並びに対応するシグナルが重なってしまうことが分かっています。ＳｉＰｅｘ法による解析でも、重なったシグナルが確かに２つの成分で構成されていることが分かり、それぞれの成分から正しいアミノ酸情報を取り出し、かつ、^１５Ｎ緩和速度の情報を取り出すことができました（図３）。このことは、従来の技術では解析が困難であったたんぱく質に対して、ＳｉＰｅｘ法が有効であることを示しています。

※）Kasai T, Koshiba S, Yokoyama J, Kigawa T (2015), Stable isotope labeling strategy based on coding theory. J Biomol NMR, 63:213-221

＜今後の期待＞

ＳｉＰｅｘ法は、ＮＭＲを用いて信号の分離を行いながらたんぱく質の情報を取得する新しい手法であり、たんぱく質の構造、動き、他の分子との結合などの解析に用いることができます。符号化、復号という情報科学の手法と、テンソル分解という数理科学の手法を組み合わせて用いることで、たんぱく質のＮＭＲ解析という生命科学の手法を革新したもので、異分野の研究者の共同研究によって実現されました。

ＳｉＰｅｘ法を用いることで、従来のＮＭＲ法では信号が重なることでたんぱく質の性質に関する情報が得られなかったたんぱく質の解析が可能になるだけでなく、ＳｉＰｅｘ法で得られるアミノ酸の情報は信号帰属にも有用なため、信号帰属が困難であったたんぱく質の解析も可能になります。特に、天然変性たんぱく質の解析や、生きている細胞内のたんぱく質を直接観測し、解析するｉｎ－ｃｅｌｌＮＭＲ法^注８）などにおいて、解析可能なたんぱく質の種類を増やすことにつながり、たんぱく質の機能や作用機構の解明という基礎研究に役立ちます。また、信号帰属に役立つアミノ酸の情報と、たんぱく質の性質に関する情報がリンクした形で得られるため、従来のＮＭＲ法で解析可能であったたんぱく質についても、より迅速、効率的に解析することができます。生命科学における基礎研究の加速はもちろんのこと、医薬品候補分子との結合を迅速に評価し改善につなげる必要がある創薬研究など応用研究にも役立つと期待できます。

＜参考図＞

図１　符号化標識法における安定同位体標識パターン（符号語表）の例

アミノ酸ごとに異なる安定同位体標識パターンを対応させる「符号語表」に従い、３パターンのたんぱく質試料（標識体）を用意する。ユビキチンたんぱく質に含まれる１８種類のアミノ酸を判別可能な符号語表の一例を示す。アミノ酸の情報を「復号」するには、標識体ごとにＮＭＲ計測を行い、同位体の比率に伴うＮＭＲ信号の強度の違いを利用する。例えば標識体１では、^１５Ｎの標識率が１００パーセントであるアミノ酸は９種類まで絞られる。さらに、標識体２と標識体３の情報を合わせると、全ての標識体において^１５Ｎの標識率が１００パーセントの強度として観測されるＮＭＲ信号は、Ｇ（グリシン）に由来すると判断できる。

図２　符号化標識法で得られたスペクトルを用いた、信号の分離と情報の取り出し

左図は、特定のアミノ酸に由来するＮＭＲ信号の分布（スペクトル）を、横軸を^１Ｈ共鳴周波数、縦軸を^１５Ｎ共鳴周波数として表したもの。赤四角で囲んだ点は、２つのＮＭＲ信号が同じ位置で重なったものだが、テンソル分解により２つのアミノ酸情報に分離することができる。さらに、テンソル分解を利用して^１５Ｎ緩和速度を測定することで、たんぱく質の動きの情報が得られる。

図３　ＳｉＰｅｘによるユビキチンたんぱく質の重なった信号の分離と情報の取り出し

８４個のアミノ酸から成るユビキチンの変異たんぱく質を用いたＳｉＰｅｘ法の実証実験。重なり合った信号が、テンソル分解により２つの成分に分けられた。各成分に含まれるアミノ酸情報を取り出すと、成分１に対応するのは２５～２６番目のＮＶ（アスパラギン－バリン）であり、成分２に対応するのは１５～１６番目のＬＥ（ロイシン－グルタミン酸）であることが分かった。また、^１５Ｎ緩和速度の情報を取り出すと、どちらも同じくらい動き（揺らぎ）のある領域であることが読み取れた。

図　情報科学（符号化標識法）と数理科学（テンソル分解）を応用したＳｉＰｅｘ法

＜用語解説＞

注１）核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、ＮＭＲ信号: 強い磁場中に置かれた原子核に電磁波を照射すると、核スピンの共鳴現象により、原子核の性質や周囲の環境に応じた周波数（共鳴周波数）の電磁波の吸収や放出が起こるが、その電磁波をＮＭＲ信号として捉えることで、物質の分子構造の解析や物性の解析を行う手法。分子の相互作用などの情報も得られるため、生命科学、医薬、化学、食品、材料物性といった幅広い分野で利用されている。ＮＭＲはＮｕｃｌｅａｒＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅの略。

注２）安定同位体: 原子番号が同じで質量の異なる同位体のうち、放射性崩壊を起こさず安定に存在するもの。たんぱく質の主要な構成元素は水素、炭素、窒素であるが、それぞれ自然界では水素１（^１Ｈ）、炭素１２（^１２Ｃ）、窒素１４（^１４Ｎ）がほとんどを占めている。このうち、^１ＨはＮＭＲ法で観測可能だが、^１２Ｃ、^１４Ｎは観測不能か困難である。そのため、物理化学的性質がほとんど変わらない安定同位体でありＮＭＲ観測が可能な^１３Ｃ、^１５Ｎに置き換えたたんぱく質試料を用いることが標準的な方法となっている。安定同位体に置き換えることでＮＭＲ観測が可能になることから、興味のある原子を観測するための標識としても利用できる。

注３）符号化標識法: 葛西卓磨　研究員らが２０１５年に発表したたんぱく質の標識方法。少ない種類の標識体で２０種類全てのアミノ酸を判別することを目指した。ＳｉＣｏｄｅ（Ｓｔａｂｌｅｉｓｏｔｏｐｅｅｎｃｏｄｉｎｇ）法ともいう。

注４）スペクトル: 各周波数において、どれくらいの強度の信号が観測されたかを表すデータ。ＮＭＲ法はラジオ波の周波数領域の電磁波を扱う分光法の一種であり、ＮＭＲ信号を共鳴周波数ごとに分解したスペクトルで表すことができる。

注５）天然変性たんぱく質: 溶液中での構造変化が大きく、たんぱく質の一部、もしくは全体にわたって一定の構造をとらないたんぱく質。従来の構造生物学では解析の対象になりにくかったが、近年では機能との関連が注目されている。

注６）^１５Ｎ緩和速度: たんぱく質分子に含まれるアミド（－ＮＨ）基の窒素ＮＭＲ信号の減衰の速さ（^１５Ｎ緩和速度）は、たんぱく質の動きの大きさや速さを反映することが知られている。^１５Ｎ標識したたんぱく質試料を用い、２次元ＮＭＲスペクトル上の各信号の減衰を測定する。たんぱく質を構成するアミノ酸のほとんどにアミド基が含まれることから、たんぱく質分子中のさまざまな箇所の動きを解析できる。

注７）テンソル、テンソル分解: テンソルは、本研究においては数値を３次元以上に並べたもの。１個の数値（０次元）はスカラー、数値を１列（１次元）に並べたものはベクトル、数値を２次元に並べたものは行列と呼ばれる。テンソル分解（テンソル因子分解ともいう）は、テンソルをより単純な形で表すこと。本研究においては、テンソルをベクトルの直積の和というより単純な形で表す方法（ｐｏｌｙａｄｉｃｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）によってテンソル分解をしている。

注８）ｉｎ－ｃｅｌｌＮＭＲ法: 水溶液中のたんぱく質をＮＭＲ測定する通常の方法に対して、生きた細胞内に導入したたんぱく質を測定する方法。細胞内はたんぱく質や核酸などの生体分子が高濃度で存在する「分子混雑」の状態で、水溶液中とは異なった環境である。ｉｎ－ｃｅｌｌＮＭＲは実際に機能している環境下のたんぱく質の解析が可能な方法として注目されている。

＜論文タイトル＞

“Amino-acid selective isotope labeling enables simultaneous overlapping signal decomposition and information extraction from NMR spectra”: ＤＯＩ：10.1007/s10858-019-00295-9