細胞中のタンパク質を全部光らせる

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超高感度プロテオーム解析の実現に向けて

2018/07/31 理化学研究所,ストラスブール大学

理化学研究所(理研)生命機能科学研究センター細胞システム制御学研究ユニットのシモン・レクラーク研修生(研究当時)と谷口雄一ユニットリーダー、ストラスブール大学国立衛生医学研究所のユーリ・アーンツ助教授の国際共同研究チームは、細胞の中にあるほぼ全ての種類のタンパク質を蛍光色素でラベル化する手法とその評価法を開発しました。

本研究成果は、蛍光イメージングによる超高感度の「プロテオーム解析[1]」を実現し、タンパク質の異常を伴う疾患の超早期診断や未知のバイオマーカー[2]の発見に貢献すると期待できます。

生体内で起こる疾病や、細胞の分化状態などを精密に探る方法の一つにプロテオーム解析があります。プロテオーム解析では、生体内に存在する数千から数万種類のタンパク質を網羅的に測定した大規模データを用いて、多角的な観点から生体状態の分析・診断を行います。しかし、この解析に一般的に用いられている測定法(二次元電気泳動法[3]、質量分析法[4])は、分析や装置のコストが高く、解析にも時間を要し、感度も限られているという課題がありました。

今回、国際共同研究チームは、超高感度(単一分子感度)・低コストでのプロテオーム解析を目指し、ほぼ全ての種類のタンパク質を蛍光色素でラベル化する標識法と、「1分子蛍光イメージング法[5]」を応用したラベル化率の評価法を開発しました。本法をヒト培養細胞に適用したところ、さまざまな大きさのタンパク質を50~90%の高効率で蛍光ラベルできることを確認しました。

本研究は、米国の科学雑誌『Bioconjugate Chemistry』の掲載に先立ち、オンライン版(7月5日付け)に掲載されました。

細胞から抽出したタンパク質のほぼ全てを蛍光色素でラベルし、1分子レベルで検出するの図

図 細胞から抽出したタンパク質のほぼ全てを蛍光色素でラベルし、1分子レベルで検出する

※国際共同研究チーム

理化学研究所 細胞システム制御学研究ユニット
ユニットリーダー 谷口 雄一(たにぐち ゆういち)
(科学技術振興機構(JST)さきがけ兼任研究者)
研修生(研究当時) シモン・レクラーク(Simon Leclerc)

仏国 ストラスブール大学 国立衛生医学研究所
助教授 ユーリ・アーンツ(Youri Arntz)

※研究支援

本研究は、科学技術振興機構(JST)戦略的創造研究推進事業 さきがけ「統合1細胞解析のための革新的技術基盤(研究総括:浜地格)」による支援を受けて行われました。

背景

細胞の中には、その生物種に特徴的なゲノムDNAが存在し、その情報をもとに、生命機能を担う数千から数万種類にわたるタンパク質が生み出されます。近年、こうしたタンパク質の発現を網羅的に調べることで、細胞や個体がどのような状態にあるかを明らかにする「プロテオーム解析」と呼ばれる分析手法が注目を集めています。例えば、細胞がウイルスに感染したり、がん化したりする際には、細胞はそれに反応してさまざまなタンパク質の発現を変化させます。プロテオーム解析を行えば、ウイルス感染やがんの診断がより確実・効率的に行えるようになり、またどのタンパク質が発症に中心的な役割を果たしているかを明らかにできます。このため、プロテオーム解析は次世代医療の診断技術として、実用化が期待されています。

現在、プロテオーム解析を行うために、主に用いられている測定法は「質量分析法」と「二次元電気泳動法」です。質量分析法では、高電圧をかけた真空中で細胞内のタンパク質分子をイオン化し、このイオンを電気・磁気的に分離することで得られるシグナルからさまざまなタンパク質を検出します。しかし、装置が高価であり、多数の試料の測定には向かず、また検出感度も限られていることから、研究や診断への幅広い応用は進んでいません。

一方、二次元電気泳動法では、タンパク質を蛍光ラベル化した後に、電気泳動により分離を行って、タンパク質の種類によって異なる分離距離からさまざまなタンパク質を検出します。装置が安価であり、比較的手軽に解析が行えるというメリットがあります。しかし、現在の蛍光検出の方法では感度が十分ではなく、少数個しか細胞内に存在しない制御タンパク質などは検出できないことから、応用の範囲が限定されていました。

そこで、国際共同研究チームは、「1分子蛍光イメージング法」と呼ばれる顕微鏡技術に着目しました。この技術は、レーザーによる蛍光励起と、単一フォトン検出カメラによる蛍光検出を組み合わせることで、生体試料内に存在する蛍光分子の局在を1分子レベルで捉える超高感度のものです。一般的には細胞や組織の観察に用いられますが、二次元電気泳動の蛍光検出に用いることでタンパク質の超高感度検出が可能になると考えました。この技術でプロテオーム解析を行うには、細胞から抽出した全てのタンパク質を1分子レベルで蛍光標識する必要があります。しかし、タンパク質に蛍光色素を結合させる標準的な手法で、細胞内のさまざまな種類のタンパク質がどのくらいの割合で蛍光ラベル化されるのかについての明確なデータはこれまでありませんでした。

研究手法と成果

国際共同研究チームは、試料内に存在するタンパク質の蛍光ラベル化率を評価する方法の開発を行いました。まず、顕微鏡観察に用いるカバーガラスの表面上に、タンパク質を結合させるための基質を一定密度で塗ります。次に、蛍光ラベル化したタンパク質をこのカバーグラスに固着化させ、1分子蛍光イメージング顕微鏡を用いて撮影し、カバーガラス上の蛍光スポットの数をカウントします。一方、100%ラベル化率のポジティブコントロールとして、基質と結合する性質のある蛍光分子を十分量反応させたカバーグラスを作製します。また、0%蛍光ラベル化率のネガティブコントロールには、未処理のカバーガラスに試料を反応させたものを用います。そして、これらの蛍光スポット数から蛍光ラベル化率を決定します(図1)。

この評価法を用い、生体内タンパク質の標準試料であるBSA(ウシ血清アルブミン)[6]をモデルタンパク質として、より高い蛍光ラベル化率を達成するための試料作製方法を開発しました。蛍光色素との結合反応溶液のpHや還元剤、界面活性剤の濃度などの条件検討により、最も高い蛍光ラベル化率の条件を探した結果、82%という高いラベル率を達成することに成功しました(図2)。

さらにこの条件検討の過程で、タンパク質と蛍光色素との結合は単純なランダム(タンパク質に結合する色素数が0〜数個の間にゆるやかに分布)ではなく、反応条件により不均一(タンパク質に結合する色素数の分布が0か数個かに二極化)、もしくは均一(ラベル化率が高く、色素の結合数もほぼ一定)に制御できることが分かりました(図3)。

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