ジスルフィド結合導入酵素によるたんぱく質の立体構造形成促進機構を解明

2019-04-172021-08-25

構造異常たんぱく質が引き起こす神経変性疾患などの原因解明に光

2019-04-16 東北大学,熊本大学,科学技術振興機構

ポイント

高速原子間力顕微鏡を用いた観察により、ジスルフィド結合導入酵素プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）が、構造未成熟な基質を捕獲する様子を可視化することに世界で初めて成功した。
高速原子間力顕微鏡により捉えたＰＤＩの動きが、たんぱく質の効率的な立体構造形成促進に重要であることを明らかにした。
ＰＤＩの基質認識機構および立体構造形成促進機構に対する理解が深まったことにより、構造異常たんぱく質が引き起こす種々の疾病の成因解明につながると期待される。

東北大学学際科学フロンティア研究所の奥村正樹　助教、東北大学多元物質科学研究所の稲葉謙次　教授（生命科学研究科、大学院理学研究科化学専攻　兼任）、熊本大学発生医学研究所の小椋光　教授、野井健太郎　博士（現　大阪大学ナノサイエンスデザイン教育研究センター　特任助教）らの研究グループは、高速原子間力顕微鏡^注１）により、ジスルフィド結合^注２）導入酵素プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）が構造未成熟な基質を捕獲する様子を可視化することに世界で初めて成功し、同酵素によるたんぱく質の立体構造形成促進機構に関する全く新しい概念を提唱しました。

細胞内には、たんぱく質高次構造の形成反応を促進する仕組みがあります。特に構造未成熟なたんぱく質の構造修復の仕組みは、我々の生体内で不良たんぱく質の蓄積を防ぐために必要不可欠です。しかしながら、いまだどのようにして細胞内の補助因子が構造未成熟なたんぱく質を認識し、構造修復のため働いているのかよく分かっていませんでした。

ＰＤＩファミリーたんぱく質^注３）の１つであるＰＤＩは、哺乳動物細胞の小胞体^注４）内で、立体構造形成前のたんぱく質にジスルフィド結合を導入させたり誤って形成されたジスルフィド結合を修復したりなどの機能を担っています。ＰＤＩの結晶構造^注５）は４つのドメインから構成されるＵ字構造であり、動きに富むことが示唆されていましたが、この動きがＰＤＩの機能発現にどう関わるか解明されていませんでした。

そこで、高速原子間力顕微鏡による１分子レベルでの観察により、ＰＤＩが酸化還元状態依存的にドメインの動きを制御していることを明らかにしました。さらに、ＢＰＴＩ、ＲＮａｓｅＡ、ラミニン、プラスミノーゲンといった形や大きさ、ジスルフィド結合の数が異なるさまざまな基質を還元変性させた状態で添加すると、ＰＤＩは二量体へ会合し、その中央に形成される空間（キャビティ）に基質が取り込まれる様子を観察することに世界で初めて成功しました。これにより、ＰＤＩが触媒するたんぱく質の酸化的フォールディング^注６）の全く新しいモデルを提唱するに至りました。

本研究成果は、２０１９年４月１５日（英国時間）に「ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ」のオンライン速報版で公開されます。

本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。

科学技術振興機構（ＪＳＴ）戦略的創造研究推進事業チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）

研究領域：「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」
（研究総括：田中啓二　東京都医学総合研究所　理事長）

１）研究課題名：「小胞体恒常性維持機構：Ｒｅｄｏｘ，Ｃａ^２＋，タンパク質品質管理のクロストーク」
研究代表者：永田和宏（京都産業大学総合生命科学部　教授）
研究期間：平成２５年１０月～平成３１年３月

２）研究課題名：「ＡＴＰ／ＧＴＰが駆動するタンパク質マシナリーの動的構造生命科学」
研究代表者：安藤敏夫（金沢大学理工研究域バイオAFM先端研究センター　特任教授）
研究期間：平成２５年１０月～平成３１年３月

科学技術振興機構（ＪＳＴ）科学技術人材育成のコンソーシアムの構築事業

「連携型博士研究人材総合育成システム（次世代研究者育成プログラム）」

支援対象者：奥村正樹（東北大学学際科学フロンティア研究所　助教）
支援期間：平成２９年５月～平成３１年３月

文部科学省新学術領域研究

研究領域：「新生鎖の生物学」（研究総括：田口英樹　東京工業大学科学技術創成研究院　教授）
研究課題名：「新生鎖の立体構造形成を支えるジスルフィド形成システムの解明」
研究代表者：稲葉謙次（東北大学多元物質科学研究所　教授）
研究期間：平成２６年７月～平成３１年３月

文部科学省新学術領域研究

研究領域：「動的構造生命」（研究総括：神田大輔　九州大学生体防御医学研究所　教授）
研究課題名：「分子認識による酸化的フォールディングの１分子観察」
研究代表者：奥村正樹（東北大学学際科学フロンティア研究所　助教）
研究期間：平成２７年４月～平成２９年３月

熊本大学発生医学研究所「発生医学の共同研究拠点」

研究課題名：「翻訳途中の新生鎖に働きかけるＰＤＩｆａｍｉｌｙの直接観察」
研究代表者：奥村正樹（東北大学学際科学フロンティア研究所　助教）
研究期間：平成２９年４月～平成３０年３月

文部科学省ナノテクノロジープラットホーム

研究課題名：「Ｘ線小角散乱法によるＰＤＩファミリー酵素とそのパートナー酵素との複合体の構造解析」
研究代表者：奥村正樹（東北大学学際科学フロンティア研究所　助教）
研究期間：平成２８年４月～平成２９年３月

公益財団法人上原記念生命科学財団、公益財団法人内藤記念科学振興財団、公益財団法人武田科学振興財団、研究代表者：奥村正樹（東北大学学際科学フロンティア研究所　助教）、および公益財団法人武田科学振興財団（研究代表者：稲葉謙次　東北大学多元物質科学研究所　教授）の研究の一環として行われました。

＜研究の背景＞

小胞体は分泌たんぱく質や膜たんぱく質が合成される細胞内小器官であり、そこにはジスルフィド結合形成を促進する酵素やたんぱく質の凝集を抑制する分子シャペロン^注７）などが存在します。ジスルフィド結合の形成、組み換えは高次構造を獲得するために必須であり、ジスルフィド結合形成が不可欠なたんぱく質には生物学的、医学的にも重要なインスリン、免疫グロブリン、血液凝固因子などが知られています。

一方で、ジスルフィド結合は誤ったシステイン間で形成されることもあります。そのような結合はたんぱく質の構造異常を誘起するため、小胞体内にはジスルフィド結合の修復システムが備えられています。不良たんぱく質の蓄積は神経変性疾患^注８）や糖尿病などを引き起こすと考えられるため、構造未成熟な不良たんぱく質の構造修復の仕組みは、我々の生体内において極めて重要な役割を担っています。

そのため、哺乳動物細胞の小胞体中にはジスルフィド結合の形成を触媒する酵素として２０種類以上ものＰＤＩファミリーたんぱく質が存在し、たんぱく質の品質管理を行っています。特にＰＤＩは、ＰＤＩファミリーたんぱく質の中でも最も研究が進んでおり、誤って形成されたジスルフィド結合を修復し、正しい酸化的フォールディングを促進する能力に長けています。しかし、大きさやジスルフィド結合の数が多様なたんぱく質に対して、ＰＤＩがどのように認識し、はたらきかけるのか、その作用機序はこれまで不明でした。

＜研究の内容と成果＞

当研究グループでは、高速原子間力顕微鏡（高速ＡＦＭ）という手法により、ＰＤＩが酸化還元状態依存的に４つのドメインで構成されるＵ字構造の開閉を制御し、この構造制御がさまざまな基質の効率的な酸化的フォールディングの触媒に重要な役割をもつことを明らかにしました。さらに、ＢＰＴＩ、ＲＮａｓｅＡ、ラミニン、プラスミノーゲンといった形や大きさ、ジスルフィド結合の数が異なるさまざまな基質を還元変性させた状態で添加すると、ＰＤＩが二量体化することを発見しました（図１、図２）。立体構造形成前の基質はＰＤＩ二量体の中央に形成される空洞に取り込まれ、そこで迅速なジスルフィド結合の導入と構造形成を受けることを明らかにしました。

この現象は、大きさやジスルフィド結合の数が異なる複数種類の基質に対しても同様に観察されることがわかりました。また、変性状態にある基質依存的に形成されたＰＤＩ二量体は基質のフォールディング状態（どの程度、立体構造形成が進んでいるか）や構造形成し易さ（フォールディング速度）に応じて寿命や形状を変えることを突き止めました。このように、二量体を形成することで生じる中央の空洞中に変性基質を捕獲し、効率的な酸化的フォールディングを促すというＰＤＩの全く新しい触媒機構を提唱しました（図３）。

＜今後の展開＞

パーキンソン病やアルツハイマー病など種々の神経変性疾患は体内で構造異常たんぱく質が過剰に蓄積することで引き起こされることが知られています。これまでにＰＤＩの変異や機能欠損を引き起こす化学修飾が、さまざまな神経変性疾患の患者から見つかっています。今回新たにＰＤＩの動的性質や二量体形成が、サイズやジスルフィド結合の数が異なるさまざまなたんぱく質のジスルフィド結合を効率的に導入する上で重要な役割を果たすことを明らかにしました。

以上の基礎的知見は、生体内における高効率・高精度なたんぱく質の構造形成促進の触媒機構の新たな解明につながり、神経変性疾患や２型糖尿病などのフォールディング病に関する有用な情報を提供するものと期待されます。

＜参考図＞

図１　ＰＤＩの二量体形成

（上図）構造未成熟な基質を添加するとＰＤＩは二量体を形成し、基質の立体構造形成に応じて単量体へと解離する。ＰＤＩ二量体を拡大すると空洞が生じていることが分かる。

（下図）この空間に基質が取り込まれる様子。この中央の空洞が、基質の酸化的フォールディングの触媒に重要な役割を果たす。

図２　基質のフォールディング状態に応じたＰＤＩの二量体形成

還元変性した基質を添加するとＰＤＩは約６０％まで二量体を形成するが、基質のフォールディング反応が進行するとＰＤＩは単量体となる。二量体化したＰＤＩが還元変性した基質に迅速にジスルフィド結合を導入することも、本研究により示された。

図３　ＰＤＩの新たな酸化的フォールディング触媒メカニズム

ＰＤＩが促進する酸化的フォールディング機構では、まず酸化型ＰＤＩが構造の開閉を利用して変性状態の基質を効率よく捕獲する。これに伴い、ＰＤＩは二量体を形成し、その中央に形成される空洞内で基質の酸化的フォールディングが効率的に進行する。基質のフォールディング状態や速度に応じてＰＤＩ二量体が寿命や形状を変えることで、さまざまな基質に対し、立体構造形成の促進および修復を行うことが示された。ＰＤＩが基質にジスルフィド結合を導入すると、自身の活性部位は還元状態になる。還元型のＰＤＩはＥｒｏ１と呼ばれる酸化酵素によって速やかに再酸化される。ＰＤＩとＥｒｏ１は酵母からヒトまで高度に保存されている。

＜用語解説＞

注１）高速原子間力顕微鏡（高速ＡＦＭ）: 基板に固定した分子を、先が極めて細い針で触れながら高速に走査することで、分子の形状と動きを１分子レベルでリアルタイムに観測するナノテクノロジー。

注２）ジスルフィド結合: 近接する２つのシステイン残基のチオール官能基（－ＳＨ）が酸化され、硫黄原子間で架橋される共有結合。たんぱく質の立体構造形成を安定化する役割がある。

注３）ＰＤＩファミリーたんぱく質: ジスルフィド結合の形成、組み換え、開裂を担う小胞体中に存在する酵素群のこと。ヒト細胞の小胞体中では２０種類以上のＰＤＩファミリーたんぱく質が存在する。

注４）小胞体: 細胞内小器官の１つであり、分泌たんぱく質が合成される。この区画で、分泌たんぱく質は酵素依存的に糖鎖修飾やジスルフィド結合形成を受ける。

注５）結晶構造: Ｘ線結晶構造解析と呼ばれる手法によって決定される分子構造。多くの場合は高分解能であり、原子レベルで分子構造を決定することができる。

注６）酸化的フォールディング: ジスルフィド結合形成と共役して、たんぱく質の立体構造が形成される反応のこと。インスリンや免疫グロブリンなど医学的にも重要な多くのたんぱく質も、このプロセスを経て、立体構造および生理機能を獲得する。

注７）分子シャペロン: たんぱく質の立体構造形成を助ける分子の総称。多くは、たんぱく質の凝集を抑制する役割を有する。「シャペロン」とはフランス語で若い女性が社交界デビューする際の介添人を意味する。

注８）神経変性疾患: 中枢神経を構成する特定の細胞群が死ぬために発症する脳神経疾患の１つ。構造異常たんぱく質の蓄積や沈着が神経細胞群の死を引き起こす主要因の１つと考えられている。

＜論文情報＞

タイトル：“Dynamic assembly of protein disulfide isomerase in catalysis of oxidative folding” （酸化的フォールディング触媒におけるＰＤＩの動的会合機構の解明）
ＤＯＩ：10.1038/s41589-019-0268-8