2019-07-26 埼玉大学,農研機構
概要
埼玉大学大学院理工学研究科の戸澤譲教授、らの共同研究グループは、「コシヒカリ」などの日本型イネが有する除草剤抵抗性遺伝子を発見し、そこにコードされるタンパク質が複数の除草剤を不活性化する仕組みを分子レベルで解明しました。
飼料用イネなど一部の稲品種が、トリケトン系除草剤処理により苗が枯死することが問題になりました。これを契機として、本研究グループは、日本型イネからトリケトン系除草剤を不活性化する酵素をコードするHIS1遺伝子を発見しました。試験管内および植物体での実験により、この遺伝子が作り出すHIS1タンパク質がトリケトン系除草剤を水酸化し、除草剤としての機能を失わせることにより日本型イネは除草剤で枯れなくなることを明らかにしました。一方、除草剤に弱い飼料イネなどの一部の稲品種では、HIS1遺伝子が機能を失っていること、さらにはこの機能欠損型HIS1遺伝子が東南アジアの稲品種に由来することを突き止めました。
単一の除草剤とその抵抗性遺伝子の組合せに依存する作物栽培は、その除草剤に抵抗性を持つ雑草の繁茂につながりますが、除草剤と抵抗性遺伝子の組合せを増やすことで、より多種類の雑草を対象に、水田での繁茂を有効に抑制できます。本研究グループが見出した遺伝子HIS1は、交配育種により、抵抗性のないイネ品種に導入することが可能です。さらに、各々の作物に固有なHIS1に類似のHIS1-LIKE (HSL) 遺伝子の情報を利用し、幅広い作物への展開も期待されます。
この研究成果は、世界中に存在する膨大な数のイネ系統の中に、今後の育種に有用な遺伝子資源がまだまだ多く眠っていることも示唆しています。今後、本研究で明らかになった知見を活用して、より有効な雑草管理が可能になると期待されます。本成果は、2019年7月26日（アメリカ東部標準時間）に、米国科学雑誌『Science』に公開されます。
ポイント
■ 飼料用イネなどの一部の品種が、トリケトン系除草剤ベンゾビシクロン（BBC）に感受性を示すことが判明しました。感受性品種を用いた遺伝子解析の結果、抵抗性と感受性を決定する単一遺伝子HIS1 (HPPD INHIBITOR SENSITIVE 1) を発見しました。
■ 除草剤感受性品種では、HIS1遺伝子に28塩基対（bp）の欠失が見られました。感受性品種で正常なHIS1を発現させると、BBCおよびその他４種類のトリケトン系除草剤への抵抗性が付与できたことから、HIS1遺伝子が日本型イネの除草剤抵抗性遺伝子であることが証明されました。
■ 双子葉の実験モデル植物であるシロイヌナズナでHIS1遺伝子を発現させると、トリケトン系除草剤全てに抵抗性を獲得しました。これにより、HIS1遺伝子の働くしくみはイネ以外の植物でも共通であることが分かりました。
■ 生物のゲノムデータベースを探索したところ、HIS1に類似するHIS1-LIKE (HSL)遺伝子群がイネ科作物に共通して見出され、イネにはHIS1に86%という高い相同性を持つOsHSL1遺伝子が存在することも分かりました。OsHSL1をシロイヌナズナに発現させたところ、テフリルトリオンという１種類のトリケトン系除草剤のみに抵抗性を与えることが確認され、新たな除草剤抵抗性遺伝子をもう一つ発見することに成功しました。
■ この研究成果は、世界中の膨大な数のイネ系統の中に、今後の育種に有用な遺伝子資源がまだまだ多く眠っていることも示唆しています。今後、本研究で明らかになった知見を活用して、より有効な雑草管理が可能になると期待されます。
研究内容
■□ 研究背景 □■
水田雑草の防除は、除草剤の開発により飛躍的に効率が高まりました。しかし、単一の除草剤成分を長年用いることにより、特定の抵抗性雑草の繁茂を促す結果も招き、抵抗性雑草対策のため各種の有効成分の開発と普及が進んでいます。近年、飼料用イネを栽培する一部の多収品種が新たに開発されたトリケトン系除草剤に感受性を示し、白化して枯死する事例が報告されました。感受性品種が作付けされる現場では、トリケトン系除草剤が使用できないため、この原因遺伝子の特定が開始されました。
図１. ベンゾビシクロン感受性品種の出現
A. ベンゾビシクロン(BBC)感受性品種（モミロマン、ハバタキ）の圃場での白化現象。B. コシヒカリ（BBC抵抗性品種）とモミロマン(BBC感受性品種)の異なるベンゾビシクロン濃度での感受性の比較実験。C. BBCは植物体内にBBC-OHの加水分解体として取り込まれて除草活性を発揮する。
□■ 研究結果：原因遺伝子の特定 ■□
研究グループでは、遺伝子解析を通じ、除草剤感受性が第2染色体の短腕に座乗している一つの遺伝子に支配されていることを明らかにしました。これらの解析結果を基に、原因遺伝子の座乗領域を狭め、11個の候補遺伝子の中から一つの遺伝子HIS1を見いだしました。「コシヒカリ」などの抵抗性品種では、HIS1遺伝子から機能するタンパク質が作られているのに対し、除草剤感受性品種では、HIS1遺伝子に28bpの欠失が見られ、遺伝子の機能が失われていました（図2）。
図２. ベンゾビシクロン(BBC)の感受性・抵抗性を決める原因遺伝子の同定
イネゲノムのマッピングによる遺伝子同定の概略を示す。28塩基対の欠失が確認された遺伝子の機能を確認するために、レトロトランスポゾンが挿入した突然変異株NG6511およびNF8046も新たに選抜した。28塩基対欠失は第４エキソン、NG6511は第１エキソン、NF8046は第５エキソンにそれぞれ認められることから、コシヒカリや日本晴のHIS1遺伝子がコードするHIS1タンパク質は、これらのHIS1変異遺伝子からは合成できない。
HIS1遺伝子領域へレトロトランスポゾンが挿入した２種類の変異株（図２）についても、除草剤感受性試験を行ったところ、それぞれ、BBCへの感受性を示すことが確認され（図３A）、確かにHIS1遺伝子の機能不全がBBC感受性の原因であることが決定づけられました。さらに、これらの変異株は、他のトリケトン系除草剤（スルコトリオンおよびメソトリオン）へも感受性を示すことを確認しました（図３BおよびC）。
図３. HIS1変異イネのトリケトン系除草剤に対する感受性試験
A. HIS1遺伝子機能を失っている変異株NGおよびNFは、ベンゾビシクロン感受性となる。NGおよびNFの親品種である日本晴(NB)は抵抗性を示す。B. 変異株NGおよびNFは、スルコトリオンおよびメソトリオンに対しても感受性を示す。C. ベンゾビシクロン以外の市販トリケトン系除草剤の構造。
□■ 研究結果：原因遺伝子の由来 ■□
国内で幅広く利用される除草剤が重要な育成品種を枯死させてしまうという「Bad news」を契機に始まった本研究は、育種分野の研究者の努力により、まず除草剤感受性の原因遺伝子の特定に至りました。続いて、この除草剤に弱い性質を与える原因になる28塩基対欠失を持つHIS1遺伝子を簡単に調査できるDNAマーカーを開発し、この遺伝子がどこからやって来たのかを調査しました。我が国のイネ育種の歴史は長く、品種の系譜が、農林水産省のデータベースに綿密に記録・整理されています。感受性品種の系譜をたどり、遺伝子解析と除草剤抵抗性試験を進めたところ、この除草剤に弱い性質を与える原因遺伝子は、図４のように、東南アジアに由来するPetaという品種に由来することを突き止めました。この情報は、今後の稲品種の改良に役立つものとなります。さらに、フィリピンなどで育種母本として利用される稲品種についてもこの変異が発見されました。これらのHIS1変異を持つ品種の情報と除草剤に強いか弱いかを判別するDNAマーカーを組み合わせることにより、今後のトリケトン系除草剤抵抗性品種の育成が期待されます。
図４. 育種系譜の解析（左図）
A. ハバタキの育種の系譜。白字の品種はBBC感受性を示した。B. モミロマンの系譜。白字の品種はBBC感受性を示した。C. DNAマーカー解析によりPetaを祖先に持つ幾つかの品種に欠失変異を確認した。また、東南アジアの著名な品種（TadukanやIR64）にも28塩基欠失変異を見出した。
□■ 研究結果：遺伝子資源としての有用性を検証 ■□
次に、我々は、感受性品種で正常なHIS1を発現させると、BBCおよびその他４種類のトリケトン系除草剤への抵抗性が付与できたことから、HIS1遺伝子が日本型イネの除草剤抵抗性遺伝子であることを証明するに至りました（図５A）。双子葉の実験モデル植物であるシロイヌナズナでHIS1遺伝子を発現させると、トリケトン系除草剤全てに抵抗性を獲得しました。これにより、HIS1遺伝子でイネ以外の双子葉作物にも除草剤抵抗性を付与できることが分かりました（図５B）。
HIS1遺伝子の配列を生物のゲノムデータベースを探索したところ、HIS1に類似するHIS1-LIKE (HSL)遺伝子群がイネ科作物に共通して見出され、イネにはHIS1に86%という高い相同性を持つOsHSL1遺伝子が存在していました。このOsHSL1をシロイヌナズナに発現させたところ、テフリルトリオン(TFT)（図３C）という１種類のトリケトン系除草剤のみに抵抗性を与えることが確認され、新たな除草剤抵抗性遺伝子をもう一つ発見することに成功しました（図５B）。
図５. 日本晴型HIS1遺伝子を発現させたイネ（A）およびシロイヌナズナ（B）の各種のトリケトン系除草剤への感受性試験の結果
A. HIS1遺伝子に28塩基欠失を持つやまだわらは、BBCをはじめとする５種のトリケトン系除草剤に試験した濃度条件で感受性を示すが、日本晴型HIS1遺伝子を強発現することにより（やまだわら P35S-HIS1）、５種全ての薬剤に抵抗性を獲得する。B. シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana Columbia）は、５種全てのトリケトン系除草剤に感受性であるが、日本晴型HIS1遺伝子を強発現することにより、５種全ての薬剤に抵抗性を獲得する。さらに、日本晴型OsHSL1遺伝子を強発現することにより、TFTにのみ抵抗性を獲得する。
□■ 研究結果：遺伝子がコードするタンパク質の機能を解明 ■□
薬剤代謝物解析により、日本型HIS1遺伝子を発現するイネでは、根から吸収したBBC-OH（図１C）が、葉において完全に消失していることも確認しています（論文中に掲載）。一方、HIS1遺伝子に欠失を持つ感受性品種においては、根から吸収したBBC-OHの葉での消長が大幅に遅れていることからも、HIS1タンパク質が、除草剤の代謝に大きな役割を果たすことが確認されました。そこで、我々は、有機化学的な解析グループとタンパク質生化学解析グループと共同作業で、HIS1タンパク質を調製し、その酵素機能を試験管内で解析することとしました。
このHIS1遺伝子がコードするアミノ酸配列の解析より、HIS1タンパク質は、2価鉄イオン・2-オキソグルタル酸依存型酸化酵素と呼ばれる2価の鉄イオン（Fe2+）および2-オキソグルタル酸（2OG）を必要とする酸化酵素のファミリーに属することが示唆されました。ところが、通常の大腸菌を利用するタンパク質発現系では、このタンパク質の調製が不可能であったため、コムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系を利用してタンパク質機能解析を進めました。
その結果、HIS1はFe2+および2OG存在下でBBC-OHを代謝することを確認し、続いて代謝物を精製し、その構造解析により、HIS1がBBC-OHの特定の位置に１酸素原子付加することにより水酸化修飾することが確認されました（図６）。さらに、BBC以外のトリケトン系除草剤についても同様の解析を進めたところ、何れの化合物も酸素原子ひとつ分の質量増加を確認し、同様な代謝により除草剤活性を不活性化していることが確認できました。詳細は論文に記載しています。
図６. HIS1タンパク質によるBBC-OHの代謝
A. HIS1タンパク質は、Fe2+および2OGの存在下で、BBC-OHを代謝する活性を示す。B. HIS1によるBBC-OH代謝物はニンジン4HPPD酵素の阻害活性、つまり除草剤活性を失っている。C. BBC-OHの代謝物をAと異なる条件で分離し、質量分析を進めたところ、代謝物にはそれぞれ16の分子量増加が確認された。D. NMRによる構造解析などにより、推定されたBBC-OH代謝物の構造と、HIS1による酵素反応式を示す。
□■ 今後の応用展開 ■□
雑草防除は、作物栽培において必要不可欠な作業です。しかしながら、近年、特定の除草剤を繰り返し使用することで除草剤に抵抗性を持つ雑草が出現しており、除草剤散布圃場でも優先的に増殖することが可能となるため、爆発的な広がりを見せています。特に大規模機械化農業を進めている諸外国では解決すべき喫緊の問題となっています。この人為的な特定雑草の繁茂を回避するには、機作の異なる複数の除草剤を交代で計画的に使用するなどの仕組みが求められているため、HIS1遺伝子は、これら諸外国の作物育種にとっても極めて有用なツールとなります。
HIS1に類似するHIS1-LIKE (HSL)遺伝子群から新たな除草剤抵抗性遺伝子OsHSL1が見いだされ、イネ以外のイネ科の作物にもHSLタンパク質をコードする遺伝子が広く存在することから、今後は様々な遺伝資源、作物ごとに遺伝子の機能解析と利用を図る研究が進むことが予想されます。
同時に、HSL遺伝子のイネ科作物における高い保存性は、もともとこの遺伝子ファミリーが除草剤抵抗性以外の重要な役割を果たしていることを示唆しています（図７）。植物におけるHSL遺伝子本来の機能を解明することにより、将来的に、新たな栽培技術の開発や、新たな農薬の開発につながる可能性もあるため、研究の発展が期待されています。
図７. イネ科作物に見出されたHIS1相同タンパク質の進化系統樹（左図）
Osはイネ（Orysa sative）、Zmはトウモロコシ（Zea mays）、Taはコムギ（Triticum aestivum）、Hvはオオムギ（Hordeum vulgare）、Sbはソルガム（Sorghum bicolor）をそれぞれ示す。
□■ 用語解説 ■□
１．イネの品種
世界で栽培されているイネ品種は、日本型（ジャポニカ）イネとインド型（インディカ）に大きく２分されます。
２．ベンゾビシクロン（Benzobicyclon, BBC）
株式会社エス・ディー・エスバイオテックで創製された水稲用除草剤です。2001年に農薬登録を取得し、BBCを含む混合剤は、水田での抵抗性雑草対策剤としても40万haを超える水田で使用されています。水田での使用に適する分子構造を付加して作製された高機能型のトリケトン系の除草剤で、チオフェニル基が付加したプロドラッグ型の薬剤であり、水田中の植物の根系周辺で加水分解され保護基が外れて吸収されることにより4-HPPD阻害剤としての薬効を示します。日本型イネはBBCに対し抵抗性を持つために国内水田面積の約20%で使用され、イネ水田用の除草剤として広く普及しています。
３．4-HPPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)
チロシンの異化代謝の第2工程に機能する酵素で4-hydroxyphenylpyruvate (HPP)をhomogentisate（HGA）に変換する働きを持ちます。植物など光合成生物では同化作用も持ち、HGAは、プラストキノン生合成系の必須な前駆体となっています。プラストキノンはカロテノイド生合成系における不飽和化反応の際に放出される水素の受容体としても作用しているため、プラストキノンの枯渇はカロテノイド生合成を間接的に阻害し、白化症状を発現させます。
４．トリケトン系除草剤
酵素4-HPPDを標的とする除草剤です。多くは水溶性で畑作に有効であるが水田での使用には不向きでしたが、BBCは上述のように水田での使用が可能です。HIS1導入植物は、BBC以外のトリケトン系薬剤（図３Cをご参照ください）に対する抵抗性も示します。日本の水田においては、2001年に上市したBBCを始めとして、2010年に上市したバイエルクロップサイエンス社のテフリルトリオン（TFT）、2011年に上市したシンジェンタ社のメソトリオン（MST）の3剤があり、これらを含有する水稲用除草剤は、2015農年度136剤が上市され、65万haの水田で使用されたと推測されます。
５．2価鉄イオン・2-オキソグルタル酸依存型酸化酵素（Fe2+-2OG oxygenase）
非ヘム型の2価鉄イオン、2-オキソグルタル酸(2OG)ならびに分子状酸素を必要とする酸化酵素。生成物に加え、多くの反応ではコハク酸と二酸化炭素を生じます。様々な基質に対し酸素付加型の酸化反応を触媒する酵素群で、植物ではフラボノイドやジベレリン、エチレンなどの植物ホルモンの生合成や代謝系にも機能していることが知られています。ヒトでも70種程度の酵素が知られていますが、ヘム鉄を利用するチトクロムP450と比較すると研究例がまだ少なく機能未知のものが多い状況です。機能型タンパク質の精製が困難な酵素が多いため、結晶構造解析例も限られています。
６. シロイヌナズナ
キャベツ等と同じアブラナ科の１年草。寿命が短く、栽培および遺伝子組換えが容易であること、ゲノムサイズが比較的小さいことから、世界中でモデル植物として研究されています。2000年に全ゲノムが解読されました。
７. DNAマーカー
DNAマーカーとは、病気や障害に対する耐性などをDNA配列の違いから見分けるために作られた目印（マーカー）のことを示します。弱い品種と強い品種を遺伝子の配列からすぐに判別することができます。
論文情報
掲載誌 Science
論文名
A rice gene that confers broad-spectrum resistance to β-triketone herbicides
(トリケトン系除草剤に広範な抵抗性を付与するイネ遺伝子)
著者名
Hideo Maeda, Kazumasa Murata, Nozomi Sakuma, Satomi Takei, Akihiko Yamazaki, Md. Rezaul Karim, Motoshige Kawata, Sakiko Hirose, Makiko Kawagishi-Kobayashi, Yojiro Taniguchi, Satoru Suzuki, Keisuke Sekino, Masahiro Ohshima, Hiroshi Kato, Hitoshi Yoshida, Yuzuru Tozawa
研究支援
農研機構 イノベーション創出強化研究推進事業
「除草剤抵抗性遺伝子HIS1ゲノム情報を使ったイネ育種・生産システムと新規創薬への展開」
農研機構 先行的・試行的研究
「食用イネから発見した新規除草剤抵抗性遺伝子に関わる分子メカニズムを明らかにする」
研究に関する問い合わせ
埼玉大学 大学院理工学研究科 教授
戸澤譲 （トザワ ユズル）
