抗体医薬品の保存安定性の向上に貢献
2018/09/28 国立研究開発法人 産業技術総合研究所
ポイント
- 立体構造に異常が生じた抗体のみを選択的に捕捉する吸着剤を開発
- 抗体医薬品の製造工程で取り残されている粒径の小さい抗体凝集体の除去が可能
- 凝集前駆体を除去すると、保管中の抗体溶液の凝集体発生が低減することを発見
概要
国立研究開発法人 産業技術総合研究所【理事長 中鉢 良治】（以下「産総研」という）バイオメディカル研究部門【研究部門長 近江谷 克裕】分子細胞育種研究グループ 千賀 由佳子 研究員と同部門 本田 真也 副研究部門長は、抗体溶液に残存する微量の抗体凝集体を選択的に除去する吸着剤を開発した。また、この吸着剤が、新たな凝集体の発生を抑制する効果も持つことを実証した。
この吸着剤は、立体構造が部分的に変化した抗体（非天然型立体構造抗体）と選択的に結合する小型人工タンパク質を含有しているため、従来技術では除去が困難だった粒径の小さい凝集体や立体構造が変化した単量体（非天然型立体構造抗体単量体）を除去できる。また、この吸着剤で処理すると、保管中の抗体溶液中の凝集体発生が低減することを発見した。今回開発した吸着剤技術は、抗体凝集体の除去だけではなく、抗体医薬品の長期安定保管への応用が期待される。
なお、この技術の詳細は、2018年9月28日（米国東部夏時間）にBioconjugate Chemistry（オンライン版）に掲載される。
凝集前駆体の除去による新たな凝集体の発生抑制
開発の社会的背景
抗体医薬品の急速な需要拡大に伴い、有効性と安全性が担保された高品質・高効率な製造技術が求められている。タンパク質である抗体医薬品は、不安定な巨大高分子（分子量15万程度）であるため、製造工程中に劣化しやすく、さまざまな目的物質由来不純物が生じる。その中でも抗体医薬品の凝集体は、薬理作用の低下だけではなく、免疫原性の原因とも考えられており、孔径0.2 µmメンブレンフィルターによる除去や、精製条件・製剤条件の最適化による凝集抑制などが行われている。これにより、抗体医薬品中の残存凝集体量は5 %未満に抑えられている。
しかしながら、2014年に発表されたFDAガイドラインは、リスク管理の観点から、凝集体量を可能な限り減らすことを製造者に推奨している。また、保管中の凝集体の変化を監視することが非常に重要とも指摘している。凝集体が時間と共に発生・成長すると考えられているため、出荷時に十分除去されていても、その後の輸送・保管・調剤・投薬プロセスで再び凝集体が増加するおそれがあるからである。
このような背景から、抗体凝集体をできるだけ除去する技術や凝集体の発生を大幅に抑制する技術が望まれていた。
研究の経緯
産総研では、バイオ医薬品産業への貢献を目指して、独自の小型人工タンパク質創製技術を抗体医薬品の不純物分析に応用する研究開発を進めてきた。その過程でアミノ酸25残基からなる小型人工タンパク質AF.2A1を創出した。AF.2A1は、天然型の立体構造の抗体には結合しないが、酸や熱、酸化などの物理的・化学的ストレスによって天然型立体構造が部分的に変化した抗体と特異的に結合する。また、さまざまな会合状態の非天然型立体構造抗体にも結合する。今回、この小型人工タンパク質を用いて、従来の粒子除去技術であるメンブレンフィルターでは取り除くことが困難なサイズの凝集体を捕捉・除去できる技術の開発に取り組んだ。
なお、この開発の一部は、国立研究開発法人 日本医療研究開発機構の委託事業「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発（国際基準に適合した次世代抗体医薬等の製造技術）」（平成27～平成29年度）による支援を受けて、産総研が参画する次世代バイオ医薬品製造技術研究組合の活動として行った。
研究の内容
今回開発した吸着剤は、AF.2A1の特異的な分子認識機能を利用したもので、サイズ分離による既存の粒子除去技術とは全く異なる原理に基づくものである。この性能を実証するため、意図的に物理的・化学的ストレスを与えた抗体溶液を調製し、AF.2A1含有吸着剤処理による非天然型立体構造抗体の選択的な除去効果を調べた。試料溶液中の凝集体の有無は、抗体の粒径を動的光散乱法で測定することで確認した。
まず、抗体をpH 2の酸性バッファーに暴露処理して、酸ストレス抗体を調整した。酸ストレス抗体の溶液には、非天然型立体構造抗体に加えて、立体構造が変化しなかった天然型立体構造抗体も混在する。また、抗体医薬品の精製工程で常用されている0.2 µmメンブレンフィルターでろ過しても取り除くことができない粒径の小さい凝集前駆体も含まれている。次に、この酸ストレス抗体の溶液と物理的・化学的ストレスを与えていない天然型立体構造抗体の溶液を、それぞれメンブレンフィルターでろ過した後に混合した。最後に、この混合溶液を今回開発したAF.2A1含有吸着剤で処理し、回収した溶液画分中の凝集体の存在を確認した。
図1に、天然型立体構造抗体だけの溶液、それに酸ストレス抗体を混合した溶液、混合溶液をAF.2A1含有吸着剤で処理した後の溶液の、粒度分布の測定結果を示す。吸着剤処理により、50 nm付近のピークが消滅し、混合前の天然型立体構造抗体の溶液の粒度分布に戻っていることがわかる。この結果より、AF.2A1含有吸着剤は、非天然型立体構造抗体を選択的に捕捉し除去する性能を有し、0.2 µmメンブレンフィルターで取り除けない粒径の小さい凝集前駆体を除去できることが明らかになった。
図1 AF.2A1含有吸着剤を用いた凝集体の除去方法（上）と抗体粒径の測定結果（下）
天然型立体構造抗体のみを含む溶液 (①：非ストレス抗体)、①と酸ストレス抗体との混合溶液 (②)、②の混合溶液からAF.2A1含有吸着剤を用いて凝集体を除いた溶液 (③) （Senga and Honda, Bioconjugate Chemistry, 2018のFigure 1を一部改変し転載）
続いて、物理的・化学的ストレスを意図的に与えていない試料に対するAF.2A1含有吸着剤の効果を確かめた。抗体医薬品の実際の製造工程を模して、3段階のクロマトグラフィー法とメンブレンフィルターろ過法で高純度に精製したヒトモノクローナル抗体を用いて、AF.2A1含有吸着剤による除去処理の効果を、処理後、一定温度で長期間（6か月）保存して評価した。保存試験開始時の試料溶液中の抗体の粒径を動的光散乱法で調べたところ、AF.2A1含有吸着剤処理の有無に関係なく、どちらも同様の粒度分布を示していた。しかし、本技術の吸着剤で処理しなかった試料溶液中では、25 ℃と37 ℃で保存した場合、3か月後から凝集体が検出された。一方、吸着剤処理した試料溶液では、長期保存後の凝集体の量が大きく減少していた（図2）。これらの結果は、従来の手法で高純度に精製した抗体医薬品にも凝集前駆体が少なからず残存していること、残存した凝集前駆体を今回開発した吸着剤で除去すると保管中の抗体溶液からの凝集体発生を低減できることを示している。
図2 抗体溶液の長期保存試験による凝集体抑制効果
このように、今回開発した吸着剤は抗体凝集体を選択的に除去できること、この吸着剤で処理すると保管中の抗体溶液からの凝集体発生を抑制できることが明らかとなった。この技術は、抗体医薬品の長期安定保管技術としての応用が見込まれる。
今後の予定
今後、開発した技術の実用化に向けて、企業との協同も視野に入れ、AF.2A1の固定化に適した安価な担体材料の選択や、実装するデバイスの開発、AF.2A1の安全性評価といった課題に取り組んでいく。
用語の説明
- ◆凝集体
- 一般に、液中に分散する分子や微粒子が集まって、より大きな粒子になること凝集といい、凝集によって生成された粒子を凝集体と呼ぶ。タンパク質は、自発的に最も安定した立体構造を形成する。しかし、何らかの原因でタンパク質に物理的・化学的刺激が加わると、異常な立体構造に変化する。これを変性という。変性した異常な立体構造は通常不安定であり、複数のタンパク質分子が集まって凝集体を形成しやすい。抗体医薬品の場合、抗体の凝集体は薬効の低下のみならず、患者に悪影響を及ぼす可能性もある。正確に評価することに加えて、可能な限り凝集体を取り除くことが求められる。
ここでは、異常な立体構造の抗体が二つ以上集まったものを凝集体と呼ぶ。 - ◆非天然型立体構造抗体
- 酸や熱、酸化などの物理的・化学的ストレスによって天然型立体構造が部分的に変化した抗体を指す。単量体だけでなく、二分子以上からなる凝集体も含む。粒子のサイズは問わない。
- ◆凝集前駆体
- ここでは、従来技術では取り除くことが困難であった粒径の小さい非天然型立体構造抗体の凝集体と非天然型立体構造抗体単量体のことを合わせて凝集前駆体と呼ぶ。
- ◆抗体医薬品
- 抗体医薬品は、疾患関連分子に特異的に結合する抗体（タンパク質）を医薬品としたものである。バイオ医薬品（生物学的製剤）に分類される。多くの場合、遺伝子組み換え技術によって人為的に作製された細胞を培養し、その後、発現させた抗体を高純度に精製して製品化される。がん細胞などに対して高い特異性を示し、高い治療効果が得られる。
- ◆目的物質由来不純物
- 製造中や保管中に生成する目的物質（ここでは、抗体）の分子変化体であり、生物活性、有効性、安全性の点で目的物質に匹敵する特性を持たないもの。ここでは、凝集前駆体、凝集体などが該当する。
- ◆免疫原性
- 一般的に、抗原が抗体の産生や細胞性免疫を誘導する性質を免疫原性と呼ぶが、抗体医薬品の場合は、バイオ医薬品に対して患者の体内で抗体が産生されることを指す。
- ◆FDAガイドライン
- 米国食品医薬品局（FDA）が示す医薬品の管理基準をFDAガイドラインと呼ぶ。FDAガイドラインには、抗体医薬品を含む医薬品の安全性・有効性を保証するために、品質管理の望ましい将来像が記載されることも多い。
- ◆AF.2A1
- 抗体の立体構造変化を特異的に認識する25個のアミノ酸からなる人工タンパク質。天然型の立体構造の抗体には結合しないが、非天然型立体構造抗体と特異的に結合する。
- ◆動的光散乱法
- 光子相関分光法の一種であり、粒子の粒径や粒度分布が得られる測定方法である。抗体医薬品の品質分析では、単量体や凝集体の測定に使用される。
ここでは結果のグラフは、横軸が粒径[nm]、縦軸が相対散乱強度[%]で表示している。
