多様な微生物が協働で工業廃水中の有害物質1,4-ジオキサンを安定的に分解

自然環境での未知微生物の役割を新たな高感度同位体追跡法で解明！

2018/06/15 　産業技術総合研究所　株式会社 日本触媒

ポイント

• 数種しか見つかっていない1,4-ジオキサン分解菌を、高感度同位体追跡法により多数発見
• 石油化学工業廃水中の1,4-ジオキサンの安定処理には多様な分解菌の共存と協働が重要
• 未知微生物の機能解明や、微生物による廃水処理の活性を維持・管理する新手法の実現に期待

概要

国立研究開発法人 産業技術総合研究所【理事長 中鉢 良治】（以下「産総研」という）環境管理研究部門【研究部門長 田中 幹也】環境微生物研究グループ 堀 知行 主任研究員、青柳 智 研究員、生物プロセス研究部門【研究部門長 田村 具博】環境生物機能開発研究グループ 菊池 義智 主任研究員、地圏資源環境研究部門【研究部門長 光畑 裕司】地圏微生物研究グループ 眞弓 大介 主任研究員らは、株式会社 日本触媒【代表取締役社長 五嶋 祐治朗】（以下「日本触媒」という）と共同で、産総研で確立した、従来法より500倍の検出感度を有する高感度同位体追跡法を用いて、石油化学工業廃水中の有害物質1,4-ジオキサンを分解する微生物を多数発見するとともに、それらが協働的に働いて安定的な分解を維持できることを明らかにした。

1,4-ジオキサンは、人への発がん性が疑われ、世界的な規制強化が進む有害物質である。近年、1,4-ジオキサンの処理方法として、低コスト・低環境負荷型の生物処理が大きな注目を集めているが、これまで1,4-ジオキサン分解菌は、時間と労力のかかる分離培養法でしか調べることができず、数種の分解菌しか知られていなかった。今回、産総研で確立した分離培養に頼らない高感度同位体追跡法を用いて、石油化学工業廃水の生物処理槽から多種多様な1,4-ジオキサン分解菌を発見し、それらの分解菌が協働して1,4-ジオキサンを安定的に除去することを見出した。これは、自然環境中の未知微生物の機能解明と動態制御につながる成果と考えられる。

この成果は、2018年6月13日（現地時間）に、Nature Publishing Groupから出版される微生物生態学分野の学術誌The ISME Journalにオンライン掲載された。

石油化学工業廃水の生物処理槽への高感度同位体追跡法の適用

開発の社会的背景

1,4-ジオキサンは、石油・化学製品の製造プロセス（図1A）にて副次的に生成され、塩素系溶剤の安定剤としても広く利用される人工の化学物質である。国際がん研究機関（IARC）や米国環境保護庁（US EPA）により、1,4-ジオキサンは人への発がん性の可能性が指摘され、その環境・排水基準が世界的に厳格化されている。

近年、1,4-ジオキサンの処理方法として、低コスト・低環境負荷型の生物処理が注目を集めている。しかし1,4-ジオキサン分解菌は、これまで時間と労力のかかる分離培養法でしか調べることができず、情報が不足していた。石油化学工業の廃水を安定的に処理できる生物処理槽（図1B）でも、1,4-ジオキサン分解菌の実体は全く分かっておらず、長い間、生物処理プロセスの評価や制御における大きな課題になっていた。

図1　石油化学工業の（A）製品製造プラントと、（B）工業廃水の生物処理槽

研究の経緯

産総研では、水資源の循環利用と安全・安心技術の開発を目指したアジア戦略「水プロジェクト」の中で、微生物学的知見に基づいた水処理再生の高活性維持管理技術に関する研究を進めており、これまでも水処理膜閉塞の発生機構解明（2017年2月23日産総研プレス発表）などに取り組んできた。今回、その一環として、産総研の高感度同位体追跡法や次世代シーケンサー解析などを用いた環境微生物研究の蓄積と、日本触媒の1,4-ジオキサンの安定な生物処理実績の蓄積を基に、これらを有機的に連携・発展させることによって、世界的に環境汚染問題が深刻化する有害物質1,4-ジオキサンの分解菌の実体解明を目指した。

なお、今回の研究の一部は、独立行政法人 日本学術振興会の科学研究費助成事業による支援を受けた。

研究の内容

日本触媒に設置されている生物処理槽の活性汚泥は数千～数万種の微生物で構成されるが、今回、これを産総研で確立した高感度同位体追跡法で分析した。自然界の大部分の炭素は¹²C（質量数12）なので、安定同位体炭素¹³C（質量数13）を用いて合成した¹³C標識1,4-ジオキサンを活性汚泥に加えて8時間振とうしたところ（図2）、¹³C標識1,4-ジオキサンが減少すると同時に¹³CO₂が生成した。次に、その活性汚泥から微生物のリボ核酸（RNA）を抽出した後、試料を入れたチューブを高速回転させる超遠心分離を行った。超遠心分離すると、チューブの上部には炭素¹²Cからなる軽いRNA分子が残り、チューブの下部には¹³C標識1,4-ジオキサン由来の同位体炭素¹³Cを含む重いRNA分子が集積する。これにより、1,4-ジオキサンが活性汚泥中の微生物により分解され、その分解した炭素の一部が微生物の生体成分として取り込まれることを確認できた。チューブ下部を3画分に分けて集め、次世代シーケンサーで100万個以上の微生物RNA分子を解析したところ、1,4-ジオキサン由来の同位体炭素¹³Cを取り込んだ微生物9種（A～I菌）を特定できた（図3）。このうち、1種（H菌）は既知の1,4-ジオキサン分解菌であるPseudonocardia dioxanivoransと同一であった。しかし、他の8種の1,4-ジオキサン分解菌はそれぞれ異なる多様な遺伝子情報を持ち、これまでに1,4-ジオキサンを分解できるという報告はなく、今回、高感度同位体追跡法を用いて初めて発見できた。さらに、最も重い画分と2番目に重い画分でだけ発見（または検出）された分解菌4種（F、G、H、I菌）は、1,4-ジオキサンだけを分解して得られる僅かなエネルギーで生存していたが、残りの分解菌5種（A、B、C、D、E菌）は、1,4-ジオキサンだけではなく、共存する化学物質（モノエチレングリコールやアルカン類など）を共代謝的に利用していることが微生物RNA分子の重さの違いから分かった。

図2 高感度同位体追跡法の概要

図3 高感度同位体追跡法により今回発見した1,4-ジオキサン分解菌

日本触媒に実際に設置されている生物処理槽の1,4-ジオキサン分解菌の動態を、2015年5月から2016年4月までの約1年間にわたり、綿密に追跡した（図4）。今回同定された1,4-ジオキサン分解菌はいずれも年間平均の相対存在量が0.001 %～1.523 %のまれな微生物であり、1,4-ジオキサンの除去率と連動して変遷していた。分解菌のうち比較的相対存在量が大きい5種（A、B、C、D、I菌）の変遷をみると、夏（7～8月）の除去率が急激に低下する時期には、5種全ての1,4-ジオキサン分解菌が減少したが、その後、D、C菌が増加に転じ、除去率はすぐに回復した。定期メンテナンスのための約1ヶ月のシステム停止期間後の、秋（10月）の除去率回復時期には、まずC菌が一旦増加してから減少した後、それを補うように続けてA、D、B菌が増加し、除去率の回復・安定化を支えた。さらに初春（3～4月）の除去率が低下する時期には、B、C、I菌が増加し、除去率の著しい低下を食い止めた。このように実際の生物処理槽内の1,4-ジオキサン分解菌はそれぞれ異なる変遷パターンを示した。この結果は、これらの分解菌は石油化学工業廃水中の1,4-ジオキサンの安定的な除去に協働的に関与していることを示している。

図4 石油化学工業廃水の生物処理槽での1,4-ジオキサン除去率と分解菌の推移

今回、石油化学工業廃水の生物処理槽中の微生物の解析に用いた高感度同位体追跡法は、これまで理解できていなかった自然環境中の未知微生物の役割を解き明かす有効なツールと考えられ、今後、さまざまな物質分解・水循環プロセスに関与する未知微生物の評価・制御技術の確立に貢献できる。

今後の予定

今後は、今回発見した1,4-ジオキサン分解菌の近縁種の情報（遺伝子やゲノムの配列情報など）から分解菌の性質を推定し、環境条件を最適化することで、石油化学工業廃水の生物処理槽内で1,4-ジオキサン分解菌の生育を活発にして、分解活性を維持・最大化する管理手法の確立を目指す。

用語の説明

◆高感度同位体追跡法

原子番号は同じで、質量数（原子量）が異なるものを同位体と総称するが、環境試料に、安定同位体炭素¹³Cで標識された化合物を加えて一定期間培養した後、そこから¹³C標識化合物を分解し取り込んで重くなった微生物リボ核酸（RNA）を超遠心で分離して、次世代シーケンサーで大規模に塩基配列を決定し、¹³Cを取り込んだ微生物種を高感度に同定する方法。高感度Stable Isotope Probing（SIP）法とも言う。

◆石油化学工業

石油や天然ガスを原料として合成繊維、合成樹脂、合成ゴム、合成洗剤などの高分子化合物を作る化学工業のこと。

◆1,4-ジオキサン

常圧・常温では無色透明の液体の人工の化学物質。分子式はC₄H₈O₂。1,4-ジオキサンは、難分解性で、水に溶け易く、比較的揮発しにくいため、自然環境中に残留しやすい。また、人への発がん性が疑われており、近年、世界的に規制が強化されている。

◆生物処理

ここでは、生活・産業廃水に含まれる有機化合物や窒素化合物などを微生物に分解させ、廃水を浄化する方法のこと。

◆分離培養法

自然環境に存在する微生物の性質を知るために、微生物を単一種として分離して純粋培養する方法。微生物学の基盤的手法であるが、近年、分離培養法では自然環境中の微生物の大部分が培養困難であることが分かってきた。

◆未知微生物

機能や性質・役割が明らかになっていない微生物のこと。自然環境中には微生物が数多く生息し、それぞれの環境条件に適応した微生物生態系が形成される。地球上の微生物の多くは、分離培養が難しく、その性質・役割はほとんど分かっていない。これらの自然環境中の未知微生物には新しい機能を持つ微生物も含まれると期待され、その活用を目指した探索・技術開発が国内外で盛んに行われている。

◆国際がん研究機関（IARC）

国際がん研究機関（International Agency for Research on Cancer, IARC）は、世界保健機関（WHO）の専門機関で、化学物質などの発がん性の調査・研究やがん対策を行うがん研究専門組織。

◆米国環境保護庁（US EPA）

米国環境保護庁（United States Environmental Protection Agency, US EPA）は、米国の環境政策全般を担当する行政組織。

◆環境・排水基準

環境基準は、環境基本法に基づいて、大気、水質、土壌の汚染や、騒音に対して、「人の健康を保護し、生活環境を保全する上で維持されることが望ましい基準」として定められる。排水基準は、水質汚濁防止法に基づいて、事業所などからの排水に含まれる有害物質などの許容濃度などを規定するもの。

◆アジア戦略「水プロジェクト」

水資源の安全確保と有効利用に関するグローバル技術開発の拠点化を目指し、2012年に産総研で立ち上げられた研究プロジェクト。現在、産総研内の7つの研究ユニットが一体となり活動を推進している（https://unit.aist.go.jp/emri/water/）。

◆水処理膜

マイクロメートルからナノメートルサイズの細孔を持ち、廃水中から粒子や細菌、ウィルスなどの不純物を除去するための膜を水処理膜と呼ぶ。細孔の大きさにより、精密ろ過膜、限外ろ過膜、ナノろ過膜、逆浸透膜などに分けられる。

◆次世代シーケンサー

従来に比べ、飛躍的に解析速度が向上した、遺伝子の塩基配列の解読装置。複数の試料に含まれる微生物の種類を1試料あたり数万から数十万種、合計で数千万種の微生物を同時並行的に同定できる。

◆活性汚泥

生活・産業廃水の浄化のために利用される微生物群（細菌類や菌類が主な構成生物）・有機汚泥の総称である。

◆リボ核酸（RNA）

リボ核酸（RNA）は、デオキシリボ核酸（DNA）と共に、塩基が鎖状につながった遺伝物質。DNAは主に情報を蓄積・保存し、RNAはその情報を元にタンパク質などを作る過程などで機能する。

◆Pseudonocardia dioxanivorans

1994年にParalesらによって1,4-ジオキサンを分解できることが報告された放線菌の一種。

◆共代謝

微生物が主要な炭素・エネルギー源となる化合物を分解・利用して生育する時に、その他の化合物を並行して分解する代謝様式のこと。ただし、並行して分解される化合物は、その微生物の生育を支えることはできない。

◆相同性

遺伝子配列が同一である割合（%）。ここでは、微生物分類に用いられる16S rRNA遺伝子配列の相同性を示す。16S rRNA遺伝子配列が97 %以上同じであれば同じ微生物種として取り扱うことが多い。

◆相対存在量

全体（100 %）に対して占める個々の割合（%）のこと。

◆近縁種

微生物分類に用いられる16S rRNA遺伝子の相同性が最も高い、データベースに登録された微生物種のこと。ここでは、これまでに分離培養されている微生物の遺伝子配列だけを対象にした。